Отец — Тимофеев Александр Георгиевич, окончил художественную академию имени И. Е. Репина. Живописец, член Союза художников России, академик МАИСУ, автор стихов. Мать — Тетеровская Тамара Теодоровна, окончила художественную академию имени И. Е. Репина. Театральный график, живописец, автор серии рисунков «Сон друидов».
В 1990 году Екатерина выиграла конкурс юных писателей и читала свои рассказы на петербургском телевидении, в программе «Вызов». В 16 лет работала в театре «ТПА» (товарищество петербургских артистов) помощником режиссёра, декоратором, художником по куклам, режиссёром праздников.
В 1997 году окончила Колледж культуры и искусств (Санкт-Петербург), отделение режиссёры.
С 1996 года начала сотрудничать с театрами как художник по костюмам, ростовым куклам и декорациям. Писала стихи для детских спектаклей. Тогда же началось сотрудничество с МЭО (эстрадным объединением), для которого создала серию ростовых кукол.
В 2006 году окончила Академию культуры (Санкт-Петербург), отделение медиадизайна.
В 1997 году, в издательстве «Прогресс» вышли первые раскраски Е.Матюшкиной к сказкам «Чиполлино», «Красная Шапочка», «Теремок», «Колобок», «Маша и медведь».
В 1999—2002 годах работала как художник с издательствами Росмэн, Олма Пресс, Нева, Белфакс, Марка, Тролль, Медный всадник П2, Праздник, Оникс, Мурзилка, а также с такими авторами как Екатерина Оковитая и Елена Хрусталёва. Иллюстрировала более 70 книг, около 150 открыток.
В 2004 году вышла первая книга Е.Матюшкиной «Лапы вверх!». Известность приобрела её серия книг «Прикольный детектив». Книги о гениальном сыщике коте да Винчи, популярны у детей 5—10 лет. Книги Матюшкиной — это одновременно и детективные истории, и весёлые сказки, и альбомы для рисования, и сборники игр. Все свои книги Екатерина иллюстрирует сама.
В 2004 году общий тираж книг Е. Матюшкиной превысил миллион экземпляров.
Начиная с 2013 года Екатерина преподает на курсах литературного мастерства «Мастер текста», организованных издательством «Астрель-СПб».
В 2015 году вышла книга Екатерины Матюшкиной «Бенуарики» с дополненной реальностью, главными героями которой являются «бенуарики» — персонажи, придуманные Николаем Копейкиным. События книги связаны с реальным местом в Санкт-Петербурге, где находится бывшая ферма Бенуа.
С 29 по 31 октября 2015 года Екатерина Матюшкина и её соавтор Екатерина Оковитая посетили Новосибирск, где состоялось несколько встреч с читателями.